產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST
T4 DNA Ligase(T4連接酶)公司正在出售的產(chǎn)品:大鼠胰島瘤細(xì)胞 γ-谷氨?;h(huán)轉(zhuǎn)移封閉多肽 支氣管敗血波氏桿菌PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠膜聯(lián)蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA試劑盒 谷胱S轉(zhuǎn)移(GST)活性比色法檢測(cè)試劑盒 熱陽(yáng)光南極桿菌 胱抑9/半胱氨蛋白抑制劑9抗體
更新時(shí)間:2024-01-12
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規(guī)格 |
A-Hc2231 | T4 DNA Ligase(T4連接酶) | 500U |
濃 度: 5U/μl
產(chǎn)品概述:
在有Mg2+和ATP存在的條件下,T4 DNA Ligase能催化雙鏈 DNA或RNA上相鄰的5′-磷酸末端和3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈DNA的平末端或粘性末端之間的連接,還可以修復(fù)雙鏈 DNA、RNA 或 DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻,但不能催化單鏈 DNA 之間的連接。
保存條件:-20℃保存。
酶儲(chǔ)存緩沖液:
10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ,50mM KCl,1mM DTT, 0.1mM EDTA,50% (v/v) glycerol。
5 × T4 DNA Ligase Buffer
250 mMTris-HCl (pH 7.5), 50mM MgCl2,50mM DTT, 5mM ATP,連接促進(jìn)劑。
來(lái) 源:純化于攜帶T4 DNA ligase 基因 的E. coli 菌株。
抑制劑和熱失活:
大于200mM的NaCl或KCl可以強(qiáng)烈抑制連接酶活性。65℃加熱 10分鐘或70℃加熱5分鐘即可失活。
單位定義:
在37℃,20分鐘內(nèi)交換1 nmole 的32PPi所需要的酶量定義為一個(gè)Weiss單位。本產(chǎn)品酶1U(Weiss Unit)相當(dāng)于200個(gè)粘性末端單位。在T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液中,16℃條件下,30分鐘能夠使50%的經(jīng)Hind III消化的λDNA 片段連接所需要的酶量為一個(gè)粘性末端單位。
質(zhì)量控制:
藍(lán)白斑分析實(shí)驗(yàn)表明白斑數(shù)小于2%;過(guò)量T4 DNA Ligase 混合超螺旋質(zhì)粒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明無(wú)核酸酶檢出;SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白純度大于99%。
PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?
試劑:
模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥(niǎo)苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程,用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴(kuò)增DNA鏈;PCR buffer溶液:對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
設(shè)備:
PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制;電泳槽:用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。
PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn):
PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成,每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟:
一、變性:
利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。
二、退火或稱(chēng)接合,復(fù)性:
在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。
三、延伸:
DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴(lài)于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴(lài)于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr(來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。
PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:
1、變性溫度和時(shí)間:
保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜WC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。
2、復(fù)性溫度和時(shí)間:
PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。
3、延伸溫度和時(shí)間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意,延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。
4、循環(huán)數(shù):
其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。
公司正在出售的產(chǎn)品:
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