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更新時間:2024-01-12
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
pUC58simpleEVL Seamless 試劑盒 | 20 次 ×3 | A-Hc2224 |
PCR基本步驟及注意事項?
一、實驗原理
PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復制。在生物體內(nèi)DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列,實現(xiàn)對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境;反應過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結(jié)束反應, 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結(jié)合,從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實驗中應該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);
2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。
1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;
2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛0暹M行稀釋。
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